Le PCR c’est une méthode de détection qui procède en copiant en millions d’exemplaires un petit bout de l’ADN du virus. Le test est mis au point de telle façon qu’il va pouvoir copier ce petit bout-là de ce virus là spécifiquement; il ne doit pas amplifier autre chose. Les millions de petits bouts obtenus, qu’on appelle « amplicons », sont ensuite mis à migrer sur un genre de gel qui agit comme un tamis : les amplicons sont chargés négativement, un courant électrique les fait migrer vers l’électrode positive, et plus les amplicons sont petits, plus ils vont vite et loin parce que c’est plus facile pour eux de passer dans le tamis. Les amplicons qui nous intéressent ont tous la même longueur, ils vont tous se retrouver au même endroit. Dans le gel il y a des molécules fluorescentes qui collent à l’ADN, ce qui permet de voir où l’amplicon se trouve, et bien sûr et surtout si on a de l’amplicon, donc si le test est positif. Pourquoi la PCR? Sans elle on n’aurait pas assez d’ADN pour voir quelquechose et la PCR va copier que ce pourquoi elle est mise au point, tel virus spécifiquement, pas autre chose. Donc si il n’y a pas de PBFD, il n’y a pas d’amplicon.
Sauf que dans la vraie vie on a souvent des « contaminations ». À force de répéter les mêmes tests on se retrouve avec de l’amplicon par ci par là, un peu partout dans le labo, et ça ne prend qu’une molécule de l’amplicon pour avoir à la fin un faux positif. On doit s’assurer que tout est beau en faisant en même temps des tests négatifs sans ADN. Si eux sont « faiblement positifs » alors là on a un problème, tous les autres positifs ne veulent plus rien dire… Tu peux demander au labo si ils ont fait des négatifs, des « blancs » comme on dit. C’est très pertinent comme demande…..
J’ai mis en bas une image d’un PCR que j’ai cochonné. Ne vous occupez pas des traînées dans le bas, c’est des artefacts qui ne veulent rien dire. En (3) on a ce qu’on appelle un « marqueur moléculaire », un mélange commercial de morceaux d’ADN de différentes longueurs. Plus le fragment est vers le haut de l’image, plus il est gros (long) parce qu’il a migré moins loin. C’est commercial, donc on connait leur grosseur, ce qui permet d’évaluer la grosseur (longueur) de nos amplicons par comparaison. La grosseur (ou intensité) de la bande qu’on voit donne une idée de la quantité d’ADN qui se retrouve dans cette bande. En (4) et en (5) vous voyez ce qu’on obtient comme résultat quand on fait une PCR sur 20 000 et 10 copies de la même bibitte respectivement. Même à 10 copies on voit très bien… C’est très sensible comme méthode. En (1) et (2) vous voyez mes contrôles négatifs (blancs). On retrouve une bande à la même hauteur, donc il y a des amplicons de la même longueur. Je n’avais pas mis d’échantillon dans ces tubes PCR. Ça veut dire que mon expérience est contaminée par des amplicons. Remarquez que j’ai mis 5 fois plus de ceux-là que de ceux en (4) et (5), mais même en réduisant l’intensité de 5 fois, on verrait encore quelquechose, un signal « faiblement positif »…… Qui peut nous laisser entendre qu’il y a entre 2 et 5 copies…. Je pense qu’un échantillon de plumes oui de sang contaminé au PBFD doit contenir au moins 200, peut-être même plusieurs milliers, de particules virales.Statistiques: Posté par Marie-France — Mar Jan 22, 2008 2:02 pm
]]>